v Résultats

 

Après ce traitement, les bactéries Gram positif sont bien colorées en violet, et les bactéries Gram négatif sont colorées en rose.

Annexe 05: Test de catalase

 

C'est une enzyme décomposant l'eau oxygénée en eau et en oxygène gazeux. La méthode consiste à prélever une colonie du germe à étudier sur l'extrémité d'une pipette Pasteur fermée que l'on plonge ensuite dans un millilitre d'eau oxygénée. Le dégagement de bulles gazeuses signe la présence de l'enzyme (Figure 16).

 

Figure 16 : Test de catalase (+)

 

Annexe 06 : Test d'oxydase

 

La recherche de l'oxydase s'effectue avec des disques prêts à l'emploi du commerce. Déposer le disque sur une lame porte-objet, l'humidifier avec deux gouttes d'eau distillée stérile et écraser la colonie testée sur le disque. Une réaction positive se traduit par un virage rapide du réactif de l’incolore au violet (Figure 17).

 

 

Figure 17 : Test d'oxydase (+).

 

Annexe 07 : Test de coagulase

 

Le test de détection consiste à incuber pendant 4 heures à 37°C un mélange de plasma oxalaté de l’homme et de la souche à tester, de préférence à partir d’une culture en gélose Chapman.

L’apparition d’un caillot est observée en inclinant le tube à 90°C. Le test de la coagulase, il existe de très rares souches de S. aureus non sécrétrices de coagulase.

Annexe 08 : La galerie classique

*La galerie biochimique comporte les tests suivant (Le Minor et al., 1993) :

-    Uréase : les bactéries qui possèdent une uréase suffisamment active transforment l’urée en carbonate d’ammonium.

Ø  La technique

Dans 0.5 ml de milieu « urée indole » faire une suspension aussi dense que possible à partir de culture sur le milieu d’Hékteon, incubation à 37°C pendant 24h.

·         La présence d’une uréase fait virer le rouge de phénol du jaune orangé au rose rouge ou rouge violacé.

-   Indole : certaines bactéries possèdent une tryptophanase, capable de scinder la molécule de tryptophane en donnant de l’indole.

Ø  La technique

·         Ajouter quelques gouttes du réactif de kovacs à une culture de 18-24 heures à une suspension dense de bactéries en milieu « urée-indole » après 18-24 heures d’incubation  à 37°C.

·         Agiter et laisser reposer.

·         La présence d’indole est révélée par anneau rouge en surface.

·         L’absence d’indole est révélée par un anneau jaune ou brun.

-  Glucose : est un sucre qui fermenter par des quelque bactérie de la famille d’entérobactériaceae.

Ø La technique

Sur  le  milieu  Hajna-kligler  «  glucose-lactose,   H2S  »,  ensemencer le culot par piqûre, incubation à 37° pendant 24h.

·         Le culot viré au jaune : glucose fermenté, (glucose positif).

·         Dans le cas culot inchangé (glucose négatif)

-  Lactose : est un sucre qui fermenter par des quelque bactérie de la famille d’entérobactériaceae.

Ø La technique

Sur le milieu Hajna-kligler « glucose-lactose, H2S », ensemencer la surface inclinée par stries serrées, incubation à 37° pendant 24h.

·         Pente virée au jaune : lactose fermenté (lactose positif).

·         Dans le cas contraire, couleur initiale inchangée rouge (lactose négatif).

-    Gaz : la production du gaz est recherchée sur le milieu de Hajna-Kligler (KIA) dont on ensemence le culot par piqûre, incubation à 37° pendant 24h.

·         La présence de quelques bulles ou d’une poche gazeuse qui décale le milieu du fond du tube : production de gaz (Gaz positif).

-   H2S : c’est la recherche d’enzyme de la thiosulfate-réductase, cette enzyme permet de réduire S2O3 - - en S- - . L’anion S- - peut être révélé grâce à la coloration noire sulfures métalliques, donc il ya production de H2S.

Ø La technique

Sur le milieu Hajna-kligler « glucose-lactose, H2S » ensemencer le culot par piqûre et la surface inclinée par stries serrées, incubation à 37° pendant 24h.

·         La production d’H2S (test positif) indique le noircissement plus ou moins prononcé de la pente et principalement du culot.

-    LDC : la lysine-décarboxylase : le décarboxylase est un enzyme qui décarboxyle les acide amines en forment l’amine correspondante avec dégagement de co2.

Ø La technique

Sur le milieu de moller + la lysine à partir d’une culture sur le milieu Hajna-Kliger préparer une suspension bactérienne dense, ensemencer les tube lysine et témoin avec quelque gouttes de la suspension, incubation à 37° pendant 24h à 4 jours. Le résultat négatif de témoin le premier jour de lecture donne un virage au jaune.

·         Le test LDC positif indique une coloration violette (présence d’une décarboxylase).

·         Le test LDC négatif indique une coloration jaune (absence d’une décarboxylase).

-   ONPG : le test ONPG est une méthode simple et rapide, qui permet de rechercher directement l’enzyme.

Ø La technique

Par 0,5 ml d’eau physiologiques stérile +des colonies prélever sur la pente de milieu KIA et le disque d’ONPG, incubation à 37°C de 2heurs à 24 heures.

·         Le test ONPG est positif lorsque la suspension se colore en jaune citrin.

·         Le test ONPG est négatif lorsque la suspension se colore en blanchâtre.

-   Citrate de Simmons : sur le milieu citrate de Simmons, par un strie central et longitudinale, ensemencer la pente avec une anse chargée incubation à37° pendant 24h à 7 jours.

·         Citrate de Simmons positif : les bactéries capable d’utiliser la citrate comme source de carbone et d’énergie et pourvues d’une citrate-perméase, donc la couleur de milieu devient bleu.

·         A l’inverse citrate de Simmons négatif : la couleur reste verte.

Annexe 09 : La galerie API 20 E

 

La galerie API 20 E est un système pour l’identification des Entérobactéries et autre bacilles Gram négatif, utilisant 20 tests biochimiques standardisés et miniaturisés, ainsi qu’une base de données (Figure 18).

 

Ø  Principe

La galerie API 20 E comporte 20 micro-tubes contenant des substrats sous forme déshydratée. Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne. Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs.

Ø  Mode opératoire

L’opération s’effectuée selon les étapes suivantes :

 

•   Réunir fond et couvercle d’une boite d’incubation et répartir environ 5 ml d’eau distillée dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide.

•   Remplir tubes et cupules des tests : |CIT |, |VP |, |GEL|, avec la suspension bactérienne.

•   Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.

•   Créer une anaérobiose dans les tests : ADH, LDC, ODC, URE, H2S en remplissant leurs cupules avec l’huile de paraffine.

•   Refermer la boite d’incubation, coder et placer à 37 °C pendant 18-24 heures.

Ø Lecture

Noter sur la fiche de résultat toutes réactions spontanées. Si le glucose est positif et/ou si 3 tests ou plus sont positif : révéler les tests nécessitant l’addition de réactifs.

-Test VP : ajouter une goutte de réactif VP1 et VP2. Attendre au minimum 10 minutes. Une couleur rose franche ou rouge indique une réaction positive.

-Test TDA : ajouter une goutte de réactif TDA. Une couleur marron foncée indique une réaction positive.

-Test IND : ajouter une goutte de réactif de Kowacks. Un anneau rouge obtenu en 2minutes indique une réaction positive.

La lecture de ces réactions se fait selon le profil numérique à l’aide du catalogue analytique API 20E.

Figure 18 : La galerie API 20 E.

 

 

 

 

Annexe 10 : Le sérotypage

Principe : La recherche est basée sur la mise en évidence d’une réaction spécifique entre un anticorps présent dans un sérum test et un antigène porté par le microorganisme étudié. Cette réaction est visualisée par une agglutination qui est le résultat macroscopique de la réaction antigène-anticorps.

Sérotypage de Salmonella 

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Annexes

Annexe 01 : Questionnaire

 

A remplir par le chef de couvoir

 

1-  Identification du couvoir

 

•  Nom du couvoir : …………………………………………………………………………

 

•  Emplacement : ……………………………………………………………………………

 

•  Date d’ouverture : ………………………………………………………………………...

 

•  Capacités du couvoir :…………………………………………………………………….

 

•  Nombre des incubateurs dans la sale d’incubation :……………………………………...

 

2-  Contrôle visuel

 

•  État générale des salles :

 

☐   Propres                        ☐ Sales

 

•  Matériel :

 

☐   Nouveau                        ☐Ancien

 

☐   Propre                            ☐ Sale

 

•  Les œufs :

 

☐   Propre             ☐ Sale

 

-  Couleurs :            ☐ Blanc                ☐ Blanc sale                ☐ Roux

 

-  Présence des taches de sang :   -  Présence de poussière :   -  présence d’autre débris :	☐   oui   ☐   oui   ☐   oui	☐   Non   ☐   Non   ☐   Non
•  L’eau :
☐   Propre		☐   Sale
☐   Limpide		☐   Souillée
- présence d’odeur particulière :	☐   Oui	☐   Non

-type de source de l’eau ……………………………………………………………………

 

3-  La ventilation

 

•  Le type de ventilation :

 

☐   Statique                      ☐ Dynamique                     ☐ Mixte

•  Aux entrées d’air, y a-t-il un filtre?

☐   Oui                                    ☐ Non

 

4-  Identification des lots

 

•  Nombre des lots : …………………………………………………………………………

 

•  Date d’arrivage des différents lots : ………………………………………………………

 

•  Séparation entre les lots :

 

☐   Oui                                    ☐ Non

 

•  Origine des lots :

 

☐   La même                            ☐ Différentes

 

•  Présence des lots suspects :

 

☐   Oui                                    ☐ Non

 

•  Incubation des lots :

 

☐   Isolée                                 ☐ Ensemble

 

•  Incubation répondant aux normes de calibrage :

 

☐   Oui                                    ☐ Non

 

5-  Contrôle des camions

 

•  Contrôle Avant transport :

 

☐   Oui                                    ☐ Non

 

•  Contrôle après transport :

 

☐   Oui                                    ☐ Non

 

•  Type des camions de transport :

 

☐   Frigorifiés                          ☐ Non frigorifiés

6-  Identification des casiers

 

•  Présence d’étiquette d’identification sur les caisses par lot :

 

☐   Oui                                    ☐ Non

 

•  Date : ……………………………………………………………………………………..

 

•  L’origine : ………………………………………………………………………………...

 

7-  Personnel

 

•  Accès au couvoir :

 

☐   Personnel seulement                          ☐ Étrangers

 

•  Personnel spécialisé par poste :

 

☐   Oui                                    ☐ Non

 

•  Tenus vestimentaire spécifique au secteur :

 

☐   Oui                                    ☐ Non

 

8-  Contrôle expérimentale des salles et des machines régulier :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

•  Fréquence des contrôles : ………………………………………………………………...

 

9-  Respect de manipulation et d’identification des lots :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

10-  Vide sanitaire

 

•  Respect de vide sanitaire :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

•  Durée de vide sanitaire : ………………………………………………………………….

 

•  Utilisation des produits et détergents au cours de vide sanitaire :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

•  Avez-vous été confrontés à des problèmes d’origine infectieuses :

☐   Oui                                     ☐ Non

- Lesquels : …………………………………………………………………………………

-Mesures prises face à ces problèmes : ………………………………………………….....

11-  Désinfection :

 

•  Quels locaux du couvoir ont été désinfectés : ……………………………………………

 

- combien de fois : ………………………………………………………………………….

 

•  Désinfection des œufs à couver : …………………………………………………………

 

☐ Oui                                        ☐ Non

 

- Techniques de désinfection : ……………………………………………………………..

 

- Désinfectants utilisés : ……………………………………………………………………

 

- Fréquence : ……………………………………………………………………………….

 

 

 

12-  Respect au circuit au sens unique :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

13-  Présence des poussins « communication avec la salle d'éclosion » :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

14-  Mélange des lots et dispersion des lots suspects dans les caisses d'éclosion :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

15-  Respect de la chronologie du transfert :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

16-  Perte de l'identification des lots à la sortie :

 

☐   Oui                                     ☐ Non

 

17-  Maitrise des flux d'air à la sortie d'éclosion « risque du duvet » :

 

☐   Oui                                     ☐ Non.

•  Le système de récupération du duvet

☐   Présent                                 ☐ Absent

Annexe 02: Milieux de cultures

 

1-  Eau peptonée tamponnée (BIO-RAD)

 

*  Composition (pour 1 litre d’eau distillée) Peptone tripsyque : 10 g

Chlorure de sodium : 5 g Phosphate disodique : 3.5 g Phosphate monopotassique : 1.5 g PH final : 7.0 +/- 0.2

 

2-  Milieu de McConkey (BIO-RAD)

 

*  Composition (pour 1 litre d’eau distillée) Peptone de caséine : 17 g

Peptone de viande : 3 g Lactose : 10 g

Mélange de sels biliaires : 1.5 g Chlorure de sodium : 5 g Rouge neutre : 0.03 g

Cristal violet : 0.001 g Agar agar : 13.5 g

pH final : 7.1

 

3-  Gélose nutritive

*  Composition (pour 1 litre d’eau distillée) Extrait de viande : 1,0 g/L

Extrait de levure : 2,5 g/L Peptone : 5,0 g/L

Chlorure de sodium : 5,0 g/L Agar-agar : 15,0 g/L

pH = 7,0

 

4-  Bouillon PRESTON

 

Extrait de viande : 10,0g Peptone : 10,0g

Chlorure de sodium : 5,0g Agar-agar :1,0g

Eau : 1000mL pH 7,5 ± 0,2

 

5-   Gélose Karmali

 

Mélange de peptones : 18,0 g Extrait de levure :                        5,0 g

Amidon de maïs :        1,0 g Chlorure de sodium :          5,0 g Charbon activé :  4,0g : Hémine :        32,0 mg Pyruvate de sodium:           0,1 g Supplément sélectif céfopérazone   32 mg

vancomycine   20 mg amphotéricine B :            10 mg Agar      :10,0 g

pH = 7,4

 

6-  Gélose Tryptone-Soja (TSA)

 

Peptone de caséine :15,00 Peptone de soja: 5,00 Chlorure de sodium : 5,00 Agar :15,00

pH: 7,3 ± 0,2v

 

7-  Gélose Hektoen (BIO-RAD)

*  Composition (pour 1 litre d’eau distillée) Protéose peptone : 12 g

Extrait de levure : 3 g Chlorure de sodium : 5 g Thiosulphate de sodium : 5 g Sels biliaires : 9 g

Citrates de fer ammoniacal : 1.5 g Salicine : 2 g

Lactose : 12 g Saccharose : 12 g Fuschine acide : 0.1 g

Bleu de bromothymol : 0.1 Agar : 14,00 g

pH: 7,5 ± 0,2

 

8-  Milieu Bile Esculine Azide (BEA)

 

Protéose peptone N° 3: 3,00 g Esculine                 :    1,00 g

Peptone de caséine : 17,00g Citrate ferrique ammoniacal : 0,5 g Extrait de levure : 5,00 g

Azide de sodium : 0,15 g Chlorure de sodium 5,00 Bile de bœuf : 10,00 g Agar : 15,00 g

pH: 7,1 ± 0,2

 

09- Milieu de Chapman (BIO-RAD)

 

*  Composition (pour 1 litre d’eau distillée) Peptone : 11 g

Extrait de viande : 1 g Chlorure de sodium : 75 g Mannitol : 15 g

Agar : 15 g

Rouge de phénol : 0.025 g pH : 7.4 à 7.5

 

10-  Violet Red Bile Dextrose Agar (BIO-RAD)

 

*  Composition (pour 1 litre d’eau distillée)

Peptone : 10g

Extrait de levure : 5 g Sels biliaires : 1.5 g Dextrose : 10 g

Chlorure de sodium : 5 g Rouge neutre : 30 g Cristal violet : 2 mg Agar : 12 g

pH final : 7.4

 

11-  Gélose SALMONELLA-SHIGELLA (S.S.)

 

*  Ingrédients en grammes pour un litre d’eau distillée ou déminéralisée. Protéose peptone : 5,00 g

Citrate ferrique ammoniacal : 1,00 g Extrait de viande de bœuf : 5,00 g Thiosulfate de sodium: 8,50 g Lactose : 10,00 g

Rouge neutre : 0,025 g Sels biliaires N° 3 : 8,50 g Vert brillant : 0,00033 g Citrate de sodium : 8,50 g Agar : 13,50 g

pH final: 6,9 ± 0,2

 

12-  Solution de neutralisants

 

*  Composition (pour 1 litre d’eau distillée) Lécithine : 1 g

Thiosulphate de sodium : 5 g Tween 80 : 30 g

Phosphate disodique : 42.6 g

Annexe 03 : Examen macroscopique des caractères culturaux

 

L’aspect des colonies dépend du milieu, de la durée et la température d’incubation. Il ne pourra être décrit convenablement qu’à partir des colonies bien isolées. La description des colonies doit mentionner plusieurs éléments :

 

·      La taille

·      La forme : bombée, plate, ombiliquée, à centre surélevé.

·      L’aspect de la surface : lisse, rugueux.

·      L’opacité : opaque, translucide, transparent.

·      La consistance : grasse, crémeuse, sèche, muqueuse.

·      Pigmentation.

 

Annexe 04 : Coloration de Gram

 

L’examen microscopique après une coloration de Gram nécessite au départ une préparation d’un frottis. Une colonie bien isolée d'une culture en milieu solide sera prélevée et mise en suspension dans une goutte d'eau distillée stérile. L’observation se fait à l’objectif x100. Cette coloration permet de différencier les bactéries selon deux critères :

-  leur forme (bacille, cocci,…etc.),

 

-  leur affinité pour les colorants, en Gram positif et Gram négatif.

Elle se déroule en plusieurs étapes qui se succèdent et consiste à : 1- Fixer de frottis.

2- Recouvrir le frottis de la solution de cristal violet. Laisser agir 1 minute. 3- Rejeter le colorant. Laver à l'eau.

4- Recouvrir la préparation de Lugol. Laisser agir 1 minute. 5- Rejeter le Lugol. Laver à l'eau.

6- Décolorer à l'alcool 95°. 7- Rincer à l'eau courante.

8-      Recouvrir la lame de la solution de Fuchsine diluée. Laisser agir quelques secondes et rejeter la Fuchsine.

9-      Laver abondamment à l'eau, égouttée, sécher entre deux feuilles de papier buvard très propres.