2008).

Les infections par Pseudomonas aeruginosa sont le plus souvent inapparentes chez les reproducteurs. En revanche, au couvoir, elles peuvent entraîner des baisses du taux d'éclosion de l'ordre de 10%. Le premier signe est l'explosion des œufs en incubateur avec une odeur caractéristique. Ensuite, les poussins éclos peuvent présenter des sacs vitellins putréfiés malodorants, ceci s'accompagnant d'une mortalité élevée dans les boîtes de transport, d'un démarrage difficile avec de nouveau une élévation de la mortalité vers le 4 e ou le 5 e jour. Certains sujets, survivants mais infectés, peuvent présenter des arthrites, de la péricardite, des abcès plantaires.

La transmission par l'œuf du bacille pyocyanique est admise, le germe se développant surtout dans le vitellus. Cependant, elle est surtout fréquente sur les troupeaux âgés, chez lesquels les coquilles sont poreuses et les pontes au sol élevées. Il s'agit plus d'une contamination de surface que d'une contamination ovarienne. De même, la contamination par les solutions de lavage et de trempage polluées a été décrite (E. Goater ., 1985).

 

 

1.   Démarche HACCP

 

 Définition

 

Selon la norme française (NF) V01-002:2008, le HACCP (analyse des dangers - points critiques pour leur maîtrise) est une démarche qui identifie, évalue et maîtrise les dangers significatifs au regard de la sécurité des aliments (AFNOR, 2013).

En Algérie, le décret exécutif N° 10-90 du 10 mars 2010 fixant les conditions et modalités d'agrément sanitaire, rend l'HACCP obligatoire aux produits animaux et d’origine animale ; « Système Hazard Analysis Critical Control Point HACCP : l’ensemble des action et des procédures écrites à mettre en place au niveau des établissements dont l’activité est liée aux produits animaux et d’origine animale pour évaluer les dangers et identifier les points critiques qui menacent la salubrité et la sécurité des aliments dans le but de les maîtriser » (Journal Officiel de la république algérienne, 2010).

              Principe

 

Le système HACCP se situe dans le prolongement des bonnes pratiques. Ces dernières constituent un préalable indispensable à la mise en place du système HACCP. Celui-ci s’attache plus particulièrement aux étapes dont des mesures de maîtrise sont applicables et essentielles pour prévenir ou éliminer un danger lié à la sécurité des denrées alimentaires ou le ramener à un niveau acceptable (Anonyme 02, 2015).

 

 

Ø  Les sept principes de ce système sans résumés dans la figure suivante :

 

 

 

Figure 09 : Principes de l’HACCP ( Anonyme 02, 2015).

 

 

 

              Méthodologie HACCP appliquée dans le couvoir

 

Le couvoir comme un segment de la chaîne de production alimentaire visant à produire un produit sûr.

Les processus du couvoir sont structurés autour de points critiques du contrôle (CCP). A l’aide des CCP, on contrôle les risques potentiels de nature biologique, chimique ou physique, qui peuvent menacer la sécurité alimentaire (Lohmann , 2001).

 

 

                    Les bonnes pratiques de l’accouvage

 

Les opérations en couvoir doivent être conçues pour faire en sorte que la présence éventuelle de contaminants soit rapidement dépistée et que même dans le cas où le dépistage se révèle inefficace, l’organisation des flux évite la dissémination accidentelle de l’infection (SNA, 2003).

                    Implantation et conception de l'établissement

 

Le choix d'isolement de l'emplacement d'un établissement d'accouvaison tend à faciliter l'application rigoureuse et efficace des différentes mesures de biosécurité tout en combinant à cette séparation physique à une séparation fonctionnelle à tous les niveaux de la chaine de production qu'il soit une production d'OAC au sein des élevages de reproducteurs ou une production de poussin d'un jour dans le couvoir (Afssa, 2000). Il est de règle pour une meilleure prévention hygiénique et sanitaire ainsi qu'une bonne maitrise des risques potentiels liés à la présence et à la circulation du personnel, d'animaux, de produits d'animaux et des objets pouvant entrainer un problème d'ordre sanitaire.

                    Maitrise sanitaire au couvoir

 

Le tableau 05 résume les neuf chapitres du PMS dans les couvoirs Gallus adhérents la charte sanitaire à titre d’exemple le cas de la salmonelle (DGAL, 2012).

 

 

Tableau 05 : PMS salmonelles dans les couvoirs Gallus adhérents la charte sanitaire (DGAL, 2012).

 

Chapitres	Éléments	Sous-éléments
A. Protection de l'établissement	A.1 Protection sanitaire vis à vis de la faune sauvage et des animaux domestiques	Protection contre les rongeurs et les insectes Couvoir séparé de tout élevage            Absence de produits autres que des OAC dans le couvoir
	A.2 Protection générale vis à vis des personnes	Le personnel des élevages ne rentre pas dans le couvoir          Accès interdit aux personnes étrangères au service
	A.3 Abords	A.3.1 Zone propre et nue aux abords immédiats
	A.4 Protection rapprochée par les sas	Conception (marche en avant, surfaces lisses)          Equipements (tenues de travail, lave-mains équipés, douche) Entretien (propre, rangé)            Fonctionnement (marche en avant respectée)
B. Aménagement de l'établissement	B.1 Locaux	Surfaces facilement nettoyables et désinfectables          Organisation générale des locaux          Conception des circuits d'air            Aménagement des locaux dans les couvoirs mixtes

 

 

 

	B.2 Matériel	Nettoyable et désinfectable facilement          Filtres de dépoussiérages disposés aux entrées d'air
C. Personnel de l'établissement	C.1 Personnel permanent	C.1.1 Formation relative aux risques en matière de santé
	C.2 Personnel occasionnel	C.2.1 Formation relative aux risques en matière de santé
D. Entrants	D.1 Animaux et produits animaux	Origine des OAC (circuit charte sanitaire)          Hygiène des OAC mis en incubation
	D.2 Eau	D.2.1 Potabilité de l'eau utilisée dans le couvoir
	D.3 Matériels de transport et emballages	D.3.1 Gestion du matériel de transport et des emballages
E. Conduite de l'établissement	E.1 Conduite de la production	Déclaration sans délai aux autorités des analyses positives (Salmonella)          Respect du fonctionnement dans les différentes zones          Espèce Gallus gallus filière ponte, filière chair et autres espèces isolées
	E.2 Traçabilité	E.2.1 Traçabilité disponible
	E.3 Entretien des locaux	Propreté des locaux                      Nettoyage et désinfection            Nettoyage des camions de transport (OAC et poussins)

 

 

 

	E.4 Gestion des déchets, cadavres et effluents d'élevage	Eaux souillées            Produits non conformes (OAC et poussins de tri)          Déchets d'éclosion (duvet, fientes, œuf non éclos...)
F. Enregistrements (tenue à jour des documents)	F.1 Registre de l'établissement	F.1.1 Plan de rappel
	F.2 Plan pour la maîtrise sanitaire de l'établissement	Plan de nettoyage désinfection            Autocontrôle visuel de la propreté des locaux          Plan de lutte contre les nuisibles
I. Analyses	I.1Mise en œuvre des procédures de prélèvements	Prélèvements effectués sous la responsabilité   du vétérinaire sanitaire Notation            Laboratoire d'analyses
	I.2 Résultats d'analyses	Mesures correctives en cas de résultats défavorables (plan maîtrise Salmonella) Notation            Résultats d'analyses disponibles dans le couvoir

 

              Risques Sanitaires

 

Les risques relatifs à chaque phase du processus de fabrication sont recensés depuis l’entrée de l’œuf au couvoir jusqu’à l’installation du poussin d’un jour. Il appartient à chaque couvoir de recenser les risques (SNA , 2003).

 

 

3.4.1 Stockage des œufs

 

•  Manque de propreté du quai de débarquement des œufs ;

 

•  Manque de propreté de la salle, des containers d’œufs, des alvéoles ;

 

•  Pas de désinfection des œufs ;

 

•  Mauvaise qualité bactériologique de l’eau de lavage ;

 

•  Mauvaise traçabilité des œufs ;

 

•  Non-application des mesures relatives aux oeufs importés.

 

Programmation de l’incubation

 

•  Mauvaise identification ;

 

•  Utilisation d’œufs ne répondant pas aux normes sanitaires ;

 

•  Œufs sales ;

 

•   Contamination d’œufs sains par des œufs porteurs de salmonelle ou mycoplasme lors de l’incubation ;

•  Contamination d’œufs sains par des œufs d’importation ;

 

                    Mise sur plateaux d’incubation

 

•  Manque de propreté de la salle et du matériel (suceurs) de mise sur plateaux et des chariots d’incubation ;

•    Manque de propreté du personnel (lavage des mains, tenue adéquate, mélanges d'œufs provenant de parquets de reproducteurs de statuts différents).

Préchauffage

 

•  Manque de propreté de la salle de préchauffage.

 

 

Incubation

 

•  Circuits ne respectant pas la marche en avant ;

 

•  Manque de propreté de la salle, des machines ;

 

•  Manque de propreté du personnel (lavage des mains, tenue) ; Non-application des mesures relatives aux oeufs importés.

Transfert

 

•  Communication avec salles d’éclosoirs contenant des poussins ;

 

•  Contamination du système de transfert par des œufs de mauvaise qualité (Pseudomonas, Aspergillus) ;

•  Allées et venues des personnels ;

 

•  Salle, machine de transfert, plateaux et chariots d’éclosion, personnel ;

 

•  Perte de l’identification au transfert ;

 

•  Risque de dispersion des lots suspects dans plusieurs éclosoirs ;

 

Eclosion

 

•  Perte de l'identification du lot à la sortie / tri ;

 

•  Manque de propreté de la salle, des machines ;

 

•  Manque de propreté du personnel (lavage des mains, tenue) ;

 

•  Non-application des mesures relatives à l’éclosion d’œufs importés ;

 

•  Non-application des mesures d’isolement des lots suspects ;

 

•  Absence de maîtrise des flux d’air en sortie éclosion.

 

 

Tri / Sexage / Vaccination

 

•  Manque de propreté de la salle, du matériel ;

 

•  Manque de propreté du personnel (pas de lavage des mains, tenue inadéquate) ;

 

•  Manque d’identification des poussins par origine.

 

Stockage / expédition

 

•  Manque de propreté de la salle, des camions, du personnel.

 

2.   Les principaux vecteurs de germes

 

 L’homme

 

C’est le principal facteur de contamination des élevages. Il peut être considéré comme une source de germes pour les oiseaux, en abritant certains agents pathogènes communs aux humains et aux oiseaux (Candida, E. coli, Salmonelles, Mycobactéries) (Butcher et Miles, 2003; Alogninouwa, 1992)

              Les animaux domestiques

 

Représentent de véritables sources d’agents pathogènes pour les élevages. D’une part ils peuvent être des vecteurs excréteurs de micro-organismes pathogènes pour les volailles et d’autre part ils peuvent jouer le rôle de vecteurs mécaniques. C’est le cas des :

-    Chien, porcs, chats, bovins, ovins pour Campylobacter spp, Mycobctéries, Salmonelles et cryptosporidies (Workman, Mathison et Lavoie, 2005)

-   Oiseaux de volières pour Mycobactéries, Chlamydia psittaci (Louzis, 1992), Paramyxovirus

(Meulemans; 1992) et Pasteurella multocida (Schelcher, 1992).

 

 

              Les animaux sauvages

 

       Mammifères sauvages

 

Surtout pour Salmonella Spp (Loven et Williams, 2003) et Pasteurella multocida

transmise par les Racoons (Friend et Franson, 1999).

 

                    Oiseaux sauvages (moineaux, pigeons, étourneaux, corbeaux…)

 

Sont de véritables nuisances aux élevages non pas par les dégâts qu’ils peuvent engendrer au niveau des bâtiments (surtout risque d’incendies) mais aussi par leur rôle dans la propagation des maladies (ce sont des vecteurs excréteurs de germes pathogènes) notamment les germes suivants (Tableau 06)

Tableau 06 : les agents pathogènes excrétés par les oiseaux sauvages.

 

L’agent pathogène	Référence
Yersinia spp	Kapperud et Rosef, 1983
Adenovirus (EDS 76)	Silim et Kheyar, 1992
Borrelia burgdorferi	Mclean et all 1993
Erysipelothrix rhusiopathiae	Reboli et Farrar, 1989
Orthomyxovirus (surtout les oiseaux aquatiques migrateurs)	Lipatov et all, 2004
Campylobacter spp   Salmonella spp	Reed et all, 2003
Paramyxovirus   Mycoplasma gallisepticum	Friend et Franson, 1999

 

 

 

Pasteurella multocida   Mycobacterium avium

 

 

              Les insectes et les acariens

 

       Les mouches et les moucherons

 

Se multiplient rapidement en milieu favorable (température et hygrométrie élevée, déchets…). Les mouches peuvent assurer le transport passif de nombreux germes (virus, bactéries, parasites) voire être des hôtes intermédiaires pour des parasites (cestodes). Les principales espèces trouvées sont :

*      Musca domestica (Mouche domestique, House fly) Elle est incriminée dans la transmission de :

Pasteurella multocida et paramyxovirus (Chermette, 1992)

 

Campylobcters Spp (Pearson, 1996)

 

E. coli (Ordeur et Mainil, 2002).

 

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus spp, Streptococcus faecalis et

Bacillus cereus (Banjo, Lawal et Adeduji, 2005)

 

*      Fania canicularis (Petite mouche domestique, Little house fly)

 

Incriminée dans la transmission de la maladie de Newcastle (Chermette, 1992)

 

*      Lucilia caezari

 

Dont les larves ayant vécu sur de la viande en putréfaction, ont été rapporter comme source de toxine botulinique (Clostridium botulinum) (Brugere – Picoux et Silim, 1992).

 

 

Jouent un important rôle dans la transmission de Campylobacter spp (Newell et Fearnly, 2003)

*      Alphitobius diaperinus, piceus (Les ténébrions ou Panzer)

 

Ils sont essentiellement vecteurs mécaniques d’agents pathogènes dont le virus de la maladie de Marek et de la maladie de Gumboro, virus de la leucose aviaire, le virus de l’influenza aviaire, le virus de la variole aviaire, de la maladie de Newcastle, les salmonelles, les colibacilles, Compylobacter spp, aspergillus, cestodes, spirures et coccidies. (Strother, Teelman et Gbur, 2005 ; Reyns, Macdougald et Mathis, 1983).

*      Menacanthus stramineus (poux)

 

Incriminé dans la transmission du virus de l’encéphalomyélite (Hoelscher, 1997)

 

*      Ornithonyssus Sylviarum

 

Dont la responsabilité dans la transmission des virus de la variole aviaire, de l’encéphalite de Saint louis et de la maladie de Newcastle a été rapporté (Chrmette, 1992).

                    Les moustiques

 

Incriminées dans la propagation du virus de la variole (Elles peuvent transmettre le virus pendant plusieurs semaines après un repas contaminant) (Butcher et al , 1999 ; Elhouadfi, 1992) et du Birnavirus (Vendvogel, 1992).

                    Les tiques

 

Peuvent transmettre Borrelia burgdorferi (Barbour et Hayes, 1986) et Poxvirus

(Elhouadfi, 1992).

 

 

 L’eau

 

L’eau peut être contaminée par des virus, des parasites et des bactéries qui risquent d’entraîner des épisodes pathologiques.

L’eau a été décrite dans la transmission de différentes pathologies infectieuses dues aux germes mentionnés dans le tableau 07.

Tableau 07 : les agents pathogènes transmis par l’eau.

 

 

L’agent pathogène	Référence
Campylobacter spp	Newell et Fearnly, 2003 ; Pearson, 1996
Salmonella spp	Lecoanet, 1992
Pasteurella multocida	Schelcher, 1992 ; Friend et Franson, 1999
Bordetella avium	Venne, 1992
Paramyxovirus	Meulemans; 1992b
Reovirus	Rekkik et Silim, 1992
E. coli	Ordeur et Mainil, 2002
Birnavirus	Vendvogel, 1992
Haemophilus paragallinarum	Haffar, 1992
Mycobacterium spp	Alogninouwa, 1992 ;Friend et Franson, 1999
Herpesvirus (Maladie de Marek)	Coudert, 1992
Virus de l’anémie infectieuse	Rekkik, 1992

 

 

Le matériel

 

Les agents pathogènes peuvent également être transmis par les équipements souillés (vue leur résistance dans le milieu extérieur). C’est le cas des germes suivants (tableau08).

 

Tableau 08 : les agents pathogènes transmis par le matériel.

 

L’agent pathogène	Référence
Birnavirus	Vendvogel, 1992
Herpesvirus (LTI)	Silim, 1992
Salmonella spp	Friend et Franson, 1999
Haemophilus paragallinarum	Haffar, 1992
Herpesvirus (Maladie de Marek)	Coudert, 1992

 

I.     Matériel

 

Pour répondre à l’objectif de la présente étude deux parties sont à réaliser, la première est spécifique à l’étude des conditions dans lesquelles se trouve le couvoir, lieu de l’étude, et qui a fait l’objet d’un questionnaire (Annexe 01) présenté au responsable du couvoir et une seconde partie est consacrée aux prélèvements et identification des microorganismes qui y sont présents.

En raison du confinement, et étant dans l’impossibilité de réaliser ce travail sur terrain et au laboratoire de microbiologie, cette partie est substituée par des travaux similaire effectués au préalable.

               Enquête

 

Un questionnaire doit être établi concernant les caractéristiques, la structure, la conception et la capacité du couvoir, la qualité d’eau et des œufs, les matériaux, les procédures de nettoyage et de désinfection…etc, afin d’évaluer le niveau d’hygiène et les mesures de biosécurité prise au niveau de ce dernier.

               Matériel de prélèvement

 

Le matériel utilisé est préparé 3 jours au préalable avant la réalisation des prélèvements en quantités suffisantes (conservé au réfrigérateur) et transporté dans une glacière propre devant être nettoyée et désinfectée après chaque série de prélèvement:

-   Pour le contrôle bactériologique de l’air :

 

On utilise des boites de Pétri contenant les milieux de culture suivants :

 

*   Gélose nutritive ;

 

*   Violet Red Bile Agar (VRBG) (gélose à la bile, au cristal violet et au glucose) ;

 

*   Milieu de Chapman ;

 

*   Gélose Hektoen.

-   Pour les prélèvements de surfaces :

 

*   Écouvillons stériles en coton (type coton tige);

 

*     Tubes à essai contenant 9 ml d’eau peptonée tamponnée plus 1 ml de solution de neutralisants des désinfectants.

*   Gabarit stérilisable d’une surface totale de 20 Cm2 ;

 

*   Lampe à pétrole ;

 

*   Alcool à brûler ;

 

*   Gants stériles ;

 

*   Marqueur indélébile ;

 

*   Sachets stomacher.

 

Matériel d’analyse

 

-   Balance électronique de précision ;

 

-   Broyeur ;

 

-   Four Pasteur ;

 

-   Autoclave pour la stérilisation ;

 

-   Une verrerie composée de tubes, erlenmeyers, flacon et autres ;

 

-   Pinces, ciseaux ;

 

-   Hotte à flux laminaire et enceinte thermorégulée ;

 

-   Papiers aluminium ;

 

-   Spatules ;

 

-   Cloches ;

 

-   Étuve réglée à 37°C ;

-   Boites de Pétri remplies de milieux de cultures spécifiques ou non ;

 

-   Bain mari ;

 

-   Pipettes jaugées de 1 ml (stérilisées après chaque série d’analyse) ;

 

-   Agitateur type vortex ;

 

-   Pipettes pasteur ;

 

-   Bec benzène ;

 

-   Galeries d’identification biochimique (galeries classiques, système API 20 E et les réactifs) ;

 

-    Sérum de lapin lyophilisé ou sérum humain (sang prélevé en tube citraté, oxalaté ou avec EDTA) pour la recherche de la staphylocoagulase ;

-   Tubes à essai contenant 9 ml d’eau peptonée tamponnée ;

 

-   Sérums polyvalents anti O et anti H pour l’identification des salmonelles ;

 

-   Milieux de cultures préparés et coulés en boites de Pétri (gélose nutritive, milieu de Chapman, gélose Hektoen, milieu SS, gélose Mc Conkey, gélose VRBG, milieu BEA, Gélose TSA, Gélose Karmali, Bouillon PRESTON, Solution de neutralisants) ;

-   Bouillon sélénite.

II.    Méthode

 

                Sites et nombre de prélèvements Pour l’air ambiant

-Au niveau de quatre endroits différents dans la salle d’incubation ainsi que dans la salle d’éclosion;

-Au niveau des machines (incubateurs et éclosoirs) à trois niveaux différents (selon la technique décrite par Tber et all 1994).

Pour les surfaces

 

-La surface de : la salle de réception, la salle préchauffage, la salle d’incubation, la salle de stockage, la salle de tri des poussins et d’expédition (en des endroits différents pour chacune);

-La surface des œufs;

 

-Les surfaces des incubateurs et des éclosoirs (en quatre endroits);

 

-Quatre plateaux d’incubation et quatre autres d’éclosion;

 

-   Duvet (en quantité suffisante).

 

                 Moment des prélèvements

 

Les prélèvements ont été réalisés en deux séries :

 

*  La première le jour même de l’éclosion ;

 

*   La deuxième : 1 à 3 jours après la fin des opérations de nettoyage / de désinfection (ils concernent l’air ambiant dans la salle d’éclosion et dans les éclosoirs, les parois de la salle d’éclosion et des éclosoirs ainsi que les plateaux d’éclosion).

                Technique de prélèvement Pour l’air ambiant

La technique consiste à ouvrir (exposer à l’air libre) des boites de Pétri contenant des milieux de culture sélectifs pour chaque bactérie recherchée pendant 10 minutes (Tber et al., 1994).

Pour les surfaces

 

Les prélèvements se font selon la technique du frottis par écouvillon. Le frottis se réalisent au moyen d’un écouvillon en coton tenu par un gant propre et frotter contre la surface à contrôler sous un angle de 45° (Figure 10 et 11) et une pression constante en la balayant selon le schéma suivant : 15 aller-retour sur la longueur et 10 aller-retour sur la largeur (pour les surfaces lisses) et en le tournant (pour les surfaces rugueuses surtout les parois).

L’écouvillon est alors récupéré dans un tube à essai contenant 9 ml d’eau peptonée tamponnée additionnée de 1 ml de solution de neutralisants des désinfectants pour tous les prélèvements réalisés au niveau du couvoir.

Les tubes à essai sont identifiés à l’aide d’un marqueur indélébile pour chaque surface prélevée (Maris, 1988 ; AFSCA, 2002).

Pour le duvet

 

Le duvet est prélevé stérilement à partir des plateaux d’éclosion, des portes, des parois et des coins de l’éclosoir dans des sachets stériles (Chen et all, 2002).

Figure 10: écouvillonnage des oeufs (Diafi, 2010).

 

 

Figure 11 : Prélèvements de surface des machines et murs (Diafi, 2010).

 

 

                 Analyses microbiologiques

 

Les analyses bactériologiques ont pour but de déterminer le niveau de contamination bactérienne de l’air ambiant et des surfaces afin d’évaluer l’efficacité des procédures de nettoyage et de désinfection.

  Germes étudies

 

Les germes recherchés et dénombrés dans cette étude sont :

 

-   La flore aérobie mésophile totale ;

 

-   Les entérobactéries ;

 

-   Les staphylocoques ;

 

-   Les salmonelles ;

 

-   Compylobacter ;

 

-   Pseudomonas aeruginosa ;

 

-   Entérocoques et streptocoques.

 

  Ensemencement et lecture

 

               Les boites de Pétri ayant servi au contrôle bactériologique de l’air

 

Elles sont mises à l’étuve dès l’arrivée au laboratoire (incubation à 37°C pendant 18 à 24 heures).

                             Les écouvillons

 

Ils sont traités le jour même du prélèvement (Selon l’AFSCA, 2002 : le temps s’écoulant entre le prélèvement et l’ensemencement ne doit en aucun cas dépasser 12 heures).

Les tubes à essai contenant les écouvillons sont mis au réfrigérateur et traités par série de trois de la manière suivante :

Chaque écouvillon est soumis à une agitation mécanique vigoureuse type Vortex pendant un temps précis de 30 secondes.

Pour chaque tube on procède de la manière suivante :

 

*   Numération de la flore aérobie mésophile totale

 

Le dénombrement est fait sur gélose nutritive standard. 0.1 ml de la solution mère est déposé aseptiquement à la surface de la gélose puis étalé par la technique de la pipette râteau.

Les boites de Pétri seront mises à l’étuve à 37°C pendant 24 heures. Toutes les colonies ayant poussé après incubation sont comptées.

*   Numération des entérobactéries

 

Leur dénombrement se fait sur milieu Violet Red Bile Agar (VRBG). 0.1 ml de la solution mère est mis aseptiquement au fond de la boite de Pétri sur lequel on verse une quantité suffisante du milieu (généralement 15 à 20 ml) (fondue et tenue au bain mari à 45 – 50 °C) et on agite pour bien mélanger (mouvement rotatoire).

Après refroidissement et solidification sur une surface parfaitement horizontale, on ajoute une deuxième couche du même milieu (de 4 à 5 ml).

Après solidification de cette deuxième couche les boites de Pétri sont incubées à 37 °C pendant 18 à 24 heures.

Seules les colonies roses violacées ou rouges de 0.5 mm de diamètre ou plus seront comptabilisées.

(Technique décrite par : Coiffier et all, 1997).

*   Numération des staphylocoques

 

On utilise le milieu de Chapman coulé en boites de Pétri. 0.1 ml de la solution mère est déposé sur la surface du milieu de Chapman et est ensuite étalé par la technique de la pipette râteau.

(Technique décrite par Marchal, Bourdon et Richard, 1982).

 

*   Recherche des salmonelles

 

. Dans l’air ambiant

 

Toutes les colonies qui se montrent semblables à celles des salmonelles sur gélose Hektoen (forme, taille, couleur), feront l’objet d’un isolement (à partir de colonie bien isolées) sur gélose Hektoen ou gélose SS.

Après incubation à 37°C pendant 24 heures, pour chaque isolement on ensemence une galerie d’identification biochimique classique supplémentée par une galerie API 20 E et on ensemence de nouveau une gélose Hektoen ou une gélose SS.

Les colonies ayant montré les caractères biochimiques des salmonelles, sont identifiées par agglutination sur lame : En utilisant des sérums polyvalents anti O et anti H, l’identification est accomplie en se referant au schéma de Kauffmann / White.

. Dans les prélèvements réalisés par écouvillonnage

 

La recherche et l’isolement se déroulent en 04 phases :

 

a.     La phase de pré-enrichissement : Les prélèvements réalisés dans de l’eau peptonée tamponnée sont incubés à 37 °C pendant 16 à 20 heures.

b.    La phase d’enrichissement : Une portion du milieu de pré-enrichissement est transférée dans un milieu d’enrichissement (bouillon au sélénite de sodium) et incubée à 37°C pendant 24 heures.

c.     Phase d’isolement : A partir du milieu d’enrichissement on ensemence deux milieux sélectifs solides : gélose Hektoen et gélose SS. L’incubation se fait à 37°C pendant 24 heures.

d.    Phase d’identification biochimique et sérologique : Même approche que celle pour les prélèvements réalisés à partir de l’air.

(Technique décrite par Sutra, Federighi et Jouve, 1998).

 

. Recherche et identification des salmonelles sur le duvet

 

(Le duvet est traité le jour même de son prélèvement) On procède de la manière suivante :

. 0.25 g de duvet est mis dans 10 ml d’eau peptonée tamponnée, bien mélangé et incubé à 37°C pendant 18 à 24 heures ;

. 2 ml du mélange précédant sont ajoutés à 20 ml de bouillon sélénite. Incubé à 37°C pendant 24 heures ;

. Isolement sur gélose Hektoen et gélose SS incubées à 37°C pendant 24 heures ;

 

. Identification biochimique et sérologique. (Technique décrite par Chirol, 1992).

* Recherche et identification de Staphylococcus aureus

 

Pour sa mise en évidence on fait recours à la recherche de la staphylocoagulase libre synthétisée par ce germe en plus de ses caractères culturaux (des colonies jaunâtres de taille moyennes, lisses brillantes, pigmentées au jaune) sur le milieu de Chapman.

A partir des boites de Pétri utilisées pour le dénombrement des staphylocoques de l’air, les colonies présentant les caractéristiques de Satphylococcus aureus sur milieu de Chapman sont isolées et ensemencées sur des boites de Pétri contenant le même milieu (une colonie par boite). Les boites de pétri sont incubées à 37°C pendant 18 à 24 heures.

10 gouttes de plasma de lapin (le plasma de lapin lyophilisé est reconstitué avec de l’eau distillée en évitant la formation de mousse) ou de plasma humain (en cas de son utilisation on procède à un contrôle avec une souche coagulase positive connue), sont mis dans un tube à hémolyse puis ensemencées massivement à partir des ré-isolements.

Les tubes sont mis à l’étuve à 37°C pendant 24 heures.

Les lectures se font chaque heure pendant les 5 premières heures et après 24 heures. Le teste de coagulase positif se traduit par une prise en masse du plasma.

(Technique décrite par Marchal, Bourdon et Richard, 1982).

 

* Recherche et identification des entérobactéries

 

-    L’isolement des germes a été fait par ensemencement des échantillons dans des boites de pétri contenant de la gélose de MAC Conkey. Ce milieu de culture a l’avantage de faire pousser toutes les entérobactéries notamment les Escherichia coli.

Les différentes boîtes ensemencées sont ensuite incubées à 37°C pendant 24 heures. La lecture est faite après 24 heures. Les colonies apparues ont été observées sur le plan macroscopique puis une colonie rose a été choisie et cultivée dans des tubes contenant de la gélose nutritive. Ces tubes ont été ensuite incubés à 37°C dans l’étuve pendant 24 heures.

-     Pour l’identification, Chaque culture pure a fait l’objet d’une coloration de Gram. Les bacilles à Gram négatif sont ensuite soumis au test d’oxydase.

Les bacilles à Gram négatif et oxydase positive sont reconnus comme des non entérobactéries, donc écartés pour la suite des investigations. Les bacilles à Gram négatif et oxydase négatif (présumés Entérobactéries) ont été soumis à d’autres tests biochimiques permettant la recherche des caractères de famille, puis ceux spécifiques à E coli.

Pour tous les prélèvements, l’identification biochimique des entérobactéries a été faite à l’aide des galeries classiques et des galeries API Système 20 E.

 

* Recherche et identification des compylobacter

 

-    Les bactéries du genre Campylobacter poussent sur milieu enrichi(le bouillon PRESTON). Une incubation à 42°C pendant 24 heures permet de sélectionner les bactéries du genre Campylobacter thermophiles (Campylobacter jejuni et Campylobacter coli) fréquemment trouvés chez les volailles.

 

Après 24 heures d'incubation, l'isolement est efIectué sur milieux solides. Deux milieux solides sont utilisés parallèlement : la gélose Karmali et la gélose Virion.

L'incubation s'effectue à 42°C au bout de 24 à 72 heures. Il est indiqué d'effectuer la lecture au bout de 48 heures. Les colonies sont non hémolytiques, plates, grisâtre, translucides avec un bord irrégulier. Elles mesurent 1 à 2 mm de diamètre et peuvent quelquefois s'étaler le long des stries d'ensemencement ou présenter un aspect mucoide L'examen microscopique direct entre lame et lamelle d'une goutte de colonie en suspension est souvent très évocateur.

 

-     L’identification de ces bactéries s’effectue à l’aide de critères simples : bacilles à gram négatif incurvés, présence d’une oxydase et généralement d’une catalase.

* Recherche et identification de Pseudomonas aeruginosa

 

-    Les bactéries du genre Pseudomonas poussent sur milieu TSA. Une incubation à 37C° pendant 24h à 48h.

La lecture des résultats se fait selon le nombre et la coloration des colonies obtenues après l’incubation des boîtes. On compte les colonies de couleur verte au cas des Pseudomonas

Les souches produit une pigmentation verte, avec une odeur caractéristique de la fleur de

« seringa » sont isolées. Les colonies isolées sont de grande taille avec un aspect bombé au centre présentant le reflet métallique et au contour irrégulier (colonies larges).

L’isolement des germes se fait par ensemencement des échantillons dans des boites de pétri contenant de la gélose héktoene, puis les incubées dans l’étuve à 37C° pendant 24h.

-      L’identification de peudomonas aeruginosa s’effectue par la réalisation de la galerie biochimique pour mettre en évidence les caractères biochimiques de cette bactérie.

 

* Recheche et identification des enterocoques et streptocoques :

 

Le milieu Bile Esculine Azide (BEA) est destiné pour la croissance et la sélection des entérocoques et streptocoques grâce leur capacité à hydrolyser l’esculine; deux examens directs ont été réalisés incluant la coloration de Gram et le test de catalase qui permettent l’orientation vers ces deux genres bactériens.

 

Afin de différencier les streptocoques des entérocoques, plusieurs tests ont été réalisés à savoir : la croissance sur milieu hyper salé, la résistance à la chaleur, résistance au tellurite de potassium et la résistance à bas niveau aux aminosides.